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《臨床微生物學(xué)檢驗實驗指導(dǎo)(供醫(yī)學(xué)檢驗衛(wèi)生檢驗醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)等專業(yè)使用全國高等院校醫(yī)學(xué)檢驗專業(yè)實驗教學(xué)規(guī)劃教材)》編著者費櫻。《臨床微生物學(xué)檢驗實驗指導(dǎo)(供醫(yī)學(xué)檢驗衛(wèi)生檢驗醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)等專業(yè)使用全國高等院校醫(yī)學(xué)檢驗專業(yè)實驗教學(xué)規(guī)劃教材)》是全國高等院校醫(yī)學(xué)檢驗專業(yè)實驗教學(xué)規(guī)劃教材之一。全書分三篇，共二十五章。第一篇臨床微生物檢驗基本技術(shù)，前四章主要介紹細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢查、細(xì)菌分離培養(yǎng)技術(shù)、細(xì)菌鑒定技術(shù)、抗菌藥物敏感性試驗及耐藥監(jiān)測，第五至十五章為臨床常見病原微生物的培養(yǎng)、鑒定或檢測方法，通過實驗課的教學(xué)，加強(qiáng)學(xué)生對基礎(chǔ)理論、基本知識和基本技能的掌握。第二篇綜合性實驗從標(biāo)本送檢要求、檢驗程序、結(jié)果解讀等方面介紹臨床各類標(biāo)本的細(xì)菌學(xué)檢測，有助于學(xué)生綜合掌握和運用所學(xué)知識，為臨床實習(xí)和工作打下基礎(chǔ)。第三篇研究創(chuàng)新性實驗重點在培養(yǎng)學(xué)生進(jìn)行科學(xué)研究的興趣和基本方法。本書可作為高等院校醫(yī)學(xué)檢驗專業(yè)、衛(wèi)生檢驗專業(yè)學(xué)生實驗用書，也可供臨床檢驗工作者和從事醫(yī)學(xué)研究的科研人員參考使用，并可用做臨床醫(yī)學(xué)、醫(yī)學(xué)影像學(xué)、麻醉學(xué)、法醫(yī)學(xué)、預(yù)防醫(yī)學(xué)及藥學(xué)等專業(yè)實驗教學(xué)的參考用書。

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第一篇臨床微生物檢驗基本技術(shù)
第一章細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢查
第一節(jié) 顯微鏡的使用
【實驗?zāi)康摹?/span>
1.掌握光學(xué)顯微鏡的結(jié)構(gòu)和原理。
2.掌握光學(xué)顯微鏡使用方法。
【實驗原理】
1.顯微鏡的基本結(jié)構(gòu) 普通光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造主要分為兩部分：機(jī)械部分和光學(xué)部分。
（1）機(jī)械系統(tǒng)
1）鏡座：是顯微鏡的底座，用以支持和穩(wěn)定整個鏡體。
2）鏡柱：是鏡座上面直立的部分，用以連接鏡座和鏡臂。
3）鏡臂：一端連于鏡柱，一端連于鏡筒，是取放顯微鏡時手握部位。
4）鏡筒：連在鏡臂的前上方，鏡筒上端裝有目鏡，下端裝有物鏡轉(zhuǎn)換器。
5）物鏡轉(zhuǎn)換器：位于鏡筒下端的旋轉(zhuǎn)盤，可自由轉(zhuǎn)動，盤上有3～4個物鏡孔。
6）載物臺：在鏡筒下方，用以放置標(biāo)本，中央有一通光孔；裝有玻片標(biāo)本推進(jìn)器，推進(jìn)器左側(cè)有彈簧夾，用以夾持玻片標(biāo)本，鏡臺下有推進(jìn)器調(diào)節(jié)輪，可調(diào)節(jié)標(biāo)本位置。
7）調(diào)焦裝置：是裝在鏡柱上的大小兩種螺旋，可調(diào)節(jié)物鏡和標(biāo)本之間的焦距。大螺旋稱粗調(diào)節(jié)器，移動時可使載物臺作較大幅度的升降，通常在使用低倍鏡時，先用粗調(diào)節(jié)器迅速找到物像。小螺旋稱細(xì)調(diào)節(jié)器，移動時可使鏡臺緩慢地升降，可作精密調(diào)焦，一般在高倍鏡下使用，可得到清晰的物像。
（2）光學(xué)系統(tǒng)
1）目鏡：裝在鏡筒的上端，其上刻有5×、10×或15×符號以表示其放大倍數(shù)，一般裝的是10×的目鏡，為便于指示圖像，鏡中裝有一根黑絲作為指針。
2）物鏡：裝在鏡筒下端的旋轉(zhuǎn)器上，一般有3～4個物鏡，其中最短的刻有“10×”符號的為低倍鏡，較長的刻有“40×”符號的為高倍鏡，最長的刻有“100×”符號的為油鏡，此外，在高倍鏡和油鏡上還常加有一圈不同顏色的線，以示區(qū)別。在物鏡上，還有鏡口率（N.A.）（也稱為數(shù)值孔徑）的標(biāo)志，它表示該鏡頭分辨力的大小，其數(shù)字越大，表示分辨率越高。
3）照明裝置：裝在鏡臺下方，包括光源和集光器。光源一般采用普通燈光，強(qiáng)度可以自由調(diào)節(jié)。集光器位于鏡臺下方的集光器架上，由聚光鏡和光圈組成，其作用是把光線集中到所要觀察的標(biāo)本上。
2.顯微鏡的放大成像原理顯微鏡的分辨率是由所用光波長短和物鏡數(shù)值孔徑?jīng)Q定，縮短使用的光波波長或增加數(shù)值孔徑可以提高分辨率。減小光波波長來提高光學(xué)顯微鏡分辨率是有限的，提高物鏡數(shù)值孔徑是提高分辨率的理想措施。增加數(shù)值孔徑，一般通過提高介質(zhì)折射率，以空氣為介質(zhì)的折射率為1，而香柏油的折射率為1.51，和載玻片1.52的折射率相近，這樣光線可以不發(fā)生折射而直接通過載玻片、香柏油進(jìn)入物鏡，從而提高分辨率。顯微鏡總的放大倍數(shù)是目鏡和物鏡放大倍數(shù)的乘積，而物鏡的放大倍數(shù)越高，分辨率越高。
【實驗器材】
普通光學(xué)顯微鏡、細(xì)菌革蘭染色標(biāo)本、香柏油、擦鏡油、擦鏡紙。
【實驗方法】
1.取鏡和放置從顯微鏡柜中取出顯微鏡，右手緊握鏡臂，左手托住鏡座，放在座前桌面上稍偏左的位置，鏡座應(yīng)距桌沿6～7cm左右，便于坐著操作。
2.對光打開光源開關(guān)，轉(zhuǎn)動旋轉(zhuǎn)器，使低倍鏡對準(zhǔn)鏡臺的通光孔，打開光圈，上升集光器，在目鏡上觀察，調(diào)節(jié)光源強(qiáng)度至視野內(nèi)的光線均勻明亮。
3.放置玻片標(biāo)本取一玻片標(biāo)本放在鏡臺上，一定使有標(biāo)本一面朝上，切不可放反，用推片器彈簧夾夾住，然后旋轉(zhuǎn)推片器螺旋，使玻片中被觀察的部分位于通光孔的正中央。
4.低倍鏡和高倍鏡使用先用低倍鏡觀察，先轉(zhuǎn)動粗調(diào)焦手輪，使載物臺上升至物鏡距標(biāo)本片約5mm處。并轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)器，使載物臺慢慢下降，直到視野中出現(xiàn)清晰的物像為止。如果物像不在視野中心，可調(diào)節(jié)推片器將其調(diào)到中心。轉(zhuǎn)動轉(zhuǎn)換器，調(diào)換為高倍鏡頭，在目鏡上觀察，此時一般能見到一個不太清楚的物像，可轉(zhuǎn)動細(xì)調(diào)節(jié)器，直到獲得清晰的物像。如果視野內(nèi)的亮度不合適，可通過升降集光器的位置或開閉光圈的大小來調(diào)節(jié)。
5.油鏡的使用方法在使用油鏡之前，先經(jīng)低、高倍鏡觀察，然后將需進(jìn)一步放大的部分移到視野的中心。將集光器上升到最高位置，光圈開到最大。轉(zhuǎn)動轉(zhuǎn)換器，使高倍鏡頭離開通光孔，在需觀察部位的玻片上滴加一滴香柏油，然后慢慢轉(zhuǎn)動油鏡，使鏡頭浸入油中，慢慢轉(zhuǎn)動細(xì)調(diào)節(jié)器至物像清晰為止。油鏡使用完畢，先用擦鏡紙沾少許擦鏡油將鏡頭上的香柏油擦去，再用干擦鏡紙擦干凈。
【實驗結(jié)果】
在顯微鏡油鏡下觀察到細(xì)菌形態(tài)。
【注意事項】
1.持鏡時必須是右手握臂、左手托座的姿勢，不可單手提取，以免零件脫落或碰撞到其他地方。
2.輕拿輕放，不可把顯微鏡放置在實驗臺的邊緣，以免碰翻落地。
3.保持顯微鏡的清潔，鏡頭必須用專用擦鏡紙擦拭，切忌口吹手抹或用布擦，機(jī)械部分用布擦拭。
4.使用完畢后，取下標(biāo)本片，轉(zhuǎn)動旋轉(zhuǎn)器使鏡頭離開通光孔，下降載物臺和集光器，關(guān)閉光圈，蓋上外罩，放回顯微鏡柜內(nèi)。
第二節(jié) 不染色標(biāo)本檢查
【實驗?zāi)康摹?/span>
了解不染色標(biāo)本的觀察方法。
【實驗原理】
有鞭毛的細(xì)菌在液體中可以運動，而無鞭毛的細(xì)菌只能發(fā)生分子顫動，以此可以觀察細(xì)菌的運動能力。
【實驗器材】
1.菌種變形桿菌、金黃色葡萄球菌8～12小時肉湯培養(yǎng)物。
2.其他載玻片、蓋玻片、凹玻片、鑷子、接種環(huán)、顯微鏡和凡士林等。
【實驗方法】
1.壓滴法用接種環(huán)取變形桿菌和金黃色葡萄球菌菌液各2～3環(huán)，分別置于兩張載玻片中央，用鑷子夾住蓋玻片覆蓋于菌液上。覆蓋時，先將蓋玻片一端接觸菌液緩緩放下，使玻片之間不產(chǎn)生氣泡，菌液不外溢為適。標(biāo)本立即置顯微鏡下觀察，先低倍鏡找到標(biāo)本，然后在高倍鏡下觀察。
2.懸滴法取變形桿菌或金黃色葡萄球菌肉湯培養(yǎng)物1環(huán)分別置蓋玻片中央，在另一凹玻片凹窩的周圍涂少許凡士林，將凹面向下，對準(zhǔn)蓋玻片中央，覆于其上，粘住蓋玻片后迅速翻轉(zhuǎn)，用小鑷子輕壓，使蓋玻片與凹玻片粘緊，密封凹窩邊緣，液滴即懸垂于凹窩中央。
先在低倍鏡下找到懸滴邊緣，再換用高倍鏡觀察。
【實驗結(jié)果】
無論是懸滴法還是壓滴法，有鞭毛的變形桿菌可見發(fā)生位移的運動現(xiàn)象，而無鞭毛的金黃色葡萄球菌不發(fā)生位置變化。
【注意事項】
1.不能使用陳舊的細(xì)菌培養(yǎng)物。
2.壓滴法的標(biāo)本不能產(chǎn)生氣泡，以免影響觀察。
第三節(jié) 細(xì)菌的涂片和革蘭染色
【實驗?zāi)康摹?/span>
1.掌握細(xì)菌涂片的制作。
2.掌握革蘭染
色方法、原理、結(jié)果觀察和意義。
【實驗原理】
革蘭染色法的原理尚不完全清楚，主要有3種學(xué)說：
1.通透性學(xué)說革蘭陽性菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)較致密，肽聚糖層厚，脂質(zhì)含量少，乙醇不易透入，反而使細(xì)胞壁脫水后形成一道屏障，阻止染料外滲。革蘭陰性菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)疏松，肽聚糖層薄，含大量脂質(zhì)，乙醇易滲入，使細(xì)胞壁通透性增加，細(xì)胞內(nèi)的染料容易被乙醇溶解脫出。
2.等電點學(xué)說革蘭陽性菌等電點（pI2～3）比革蘭陰性菌（pI4～5）低，一般染料酸堿度在pH7.0左右，電離后革蘭陽性菌所帶的負(fù)電荷比革蘭陰性菌多，故與帶正電荷的堿性染料結(jié)晶紫結(jié)合牢固，不易脫色。
3.化學(xué)學(xué)說革蘭陽性菌菌體含大量核糖核酸鎂鹽，可與碘、結(jié)晶紫牢固結(jié)合，使已著色的細(xì)菌不被乙醇脫色；革蘭陰性菌菌體含核糖核酸鎂鹽很少，故易被脫色。
【實驗器材】
1.菌種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌18～24小時斜面培養(yǎng)物。
2.其他革蘭染液、玻片、生理鹽水、酒精燈、接種環(huán)、顯微鏡等。
【實驗方法】
1.細(xì)菌涂片標(biāo)本的制作
（1）涂片：取潔凈玻片一張，用記號筆劃分兩格并標(biāo)記金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌，用接種環(huán)按無菌操作取1～2環(huán)生理鹽水在玻片上，刮取少許菌苔，在生理鹽水中研磨成乳濁狀，涂成直徑約1cm2的均勻薄膜，然后立即將接種環(huán)燒灼滅菌。同法取大腸埃希菌液于另一格中涂片。
（2）干燥：涂片一般在室溫下自然干燥，若須迅速干燥，可將涂片膜面朝上，在火焰上方的熱空氣中加溫干燥，但切勿緊靠火焰，以免將標(biāo)本烤干。
（3）固定：涂片干燥后，在酒精燈火焰上迅速來回通過三次，注意溫度不能太高，以玻片反面觸及皮膚，熱而不燙為度。固定的目的一是殺死細(xì)菌，二是使菌體與玻片黏附牢固，染色時不被染液和水沖掉，三是可凝固細(xì)胞質(zhì)，改變細(xì)菌胞壁對染料的通透性。
2.革蘭染色步驟
（1）初染：將已固定的涂片置染色架上，滴加結(jié)晶紫1～2滴，1分鐘后用細(xì)水流輕輕沖洗。
（2）酶染：滴加碘液1～2滴，1分鐘后用細(xì)水流輕輕沖洗。
（3）脫色：95%乙醇溶液脫色，加乙醇后輕輕晃動玻片，約30秒后用細(xì)水流輕輕沖洗。
（4）復(fù)染：滴加稀釋石炭酸復(fù)紅1～2滴，30秒后用細(xì)水流輕輕沖洗。待標(biāo)本自干或用吸水紙印干后，置油鏡下觀察。
【實驗結(jié)果】
金黃色葡萄球菌是革蘭陽性球菌，被染成紫色；大腸埃希菌是革蘭陰性桿菌，被染成紅色。
【注意事項】
1.涂片厚薄要適宜，菌膜應(yīng)該薄而均勻。
2.水洗時，水流不宜過大，避免水流直接對準(zhǔn)菌膜沖洗。
3.菌種應(yīng)選用對數(shù)生長期的菌種。
第四節(jié) 細(xì)菌的特殊染色技術(shù)和觀察
【實驗?zāi)康摹?/span>
1.掌握鞭毛染色法的基本原理和操作方法。
2.掌握芽孢染色法的基本原理和操作方法。
3.掌握莢膜染色法的基本原理和操作方法。
【實驗原理】
1.鞭毛染色法在染色前先用媒染劑處理，讓它沉積在鞭毛上，使鞭毛直徑加粗，然后再進(jìn)行染色。常用的媒染劑由丹寧酸和氯化高鐵或鉀明礬等配制而成。
2.芽孢染色法芽孢是利用細(xì)菌細(xì)胞不同部分與染料的親和力不同，用特殊染色法使之顯示出不同的顏色。芽孢染色法就是根據(jù)芽孢具有既難以染色而一旦染上色后又不易脫色的特點而設(shè)計的。除了用著色力強(qiáng)的染料外，還需加熱以促進(jìn)芽孢著色�？兹妇G染色法，此染料不僅可以進(jìn)入菌體，而且也可以進(jìn)入芽孢，進(jìn)入菌體的染料可經(jīng)水洗脫色，而進(jìn)入芽孢的染料則難以透出，若再用沙黃進(jìn)行復(fù)染，此時菌體即被染成紅色，而芽孢難著色，仍呈綠色，進(jìn)而更明顯地襯托出芽孢，便于觀察。
3.莢膜染色法由于莢膜與染料間的親和力弱，不易著色，通常采用負(fù)染色法，即設(shè)法使菌體和背景著色而莢膜不著色，從而使莢膜在菌體周圍呈一透明圈。由于莢膜的含水量在90%以上，故染色時一般不加熱固定，以免莢膜皺縮變形。
【實驗器材】
1.菌種變形桿菌、枯草芽孢桿菌、肺炎鏈球菌。
2.染色液 Leifson染色液、芽孢染色液（5%孔雀綠水溶液、0.5%蕃紅水溶液）、莢膜染色液。
3.其他載玻片、擦鏡紙、吸水紙、記號筆、玻片擱架、鑷子、接種環(huán)，顯微鏡。
【實驗方法】
1.鞭毛染色法
（1）清洗玻片：選擇新的玻片，為了避免玻片相互重疊，應(yīng)將玻片插在專用金屬架上，然后將玻片置洗衣粉過濾液中（洗衣粉煮沸后用濾紙過濾，以除去粗顆粒），煮沸20分鐘。取出稍冷后用自來水沖洗、晾干，再放入濃洗液中浸泡5～6天，使用前取出玻片，用自來水沖去殘酸，再用蒸餾水洗。將水瀝干后，放入95%乙醇溶液中脫水。
（2）菌液的制備及制片：在染色前將待染細(xì)菌在新配制的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面上連續(xù)培養(yǎng)3～5代，以增強(qiáng)細(xì)菌的運動力。最后一代菌種培養(yǎng)12～16小時后，用接種環(huán)挑取斜面與冷凝水交接處的菌液數(shù)環(huán)，移至盛有1ml無菌鹽水的試管中，使菌液呈輕度混濁，37℃恒溫箱中靜置10分鐘。用記號筆在潔凈的玻片上劃分3個相等的區(qū)域，吸取少量菌液滴在玻片第一個小區(qū)的一端，立即傾斜玻片，使菌液緩慢地流向另一端，用吸水紙吸去多余的菌液，自然干燥。
（3）染色：加染色液于第一區(qū)，使染料覆蓋涂片。隔數(shù)分鐘后再將染料加入第二區(qū)，依此類推，其目的是確定最合適的染色時間，而且節(jié)約材料。
（4）水洗：在沒有傾去染料的情況下，就用蒸餾水輕輕地沖去染料，否則會增加背景的沉淀。
（5）干燥：自然干燥。
（6）鏡檢：先低倍觀察，再高倍觀察，最后再用油鏡觀察。
2.芽孢染色法
（1）制備菌液：加1～2滴無菌鹽水于小試管中，用接種環(huán)從斜面上挑取2～3環(huán)的枯草芽孢桿菌于試管中并充分混勻。
（2）加染色液：加5%孔雀綠水溶液2～3滴于小試管中，用接種環(huán)攪拌使染料與菌液充分混合。
（3）加熱：沸水浴15～20分鐘。
（4）涂片：用接種環(huán)從試管底部挑2環(huán)菌液，涂片并晾干。
（5）固定：將涂片來回通過酒精燈火焰3次。
（6）脫色：用水洗直至流出的水中無孔雀綠顏色為止。
（7）復(fù)染：加蕃紅水溶液染色5分鐘后，傾去染色液，不用水洗，直接用吸水紙吸干后鏡檢。
3.莢膜染色法
（1）涂片：按常規(guī)方法將肺炎鏈球菌制成一薄的涂片，自然干燥，加熱固定。
（2）染色：滴加結(jié)晶紫染液1分鐘。
（3）脫色：用20%CuSO4溶液洗去結(jié)晶紫，勿水洗，直接用吸水紙吸干后鏡檢。
【實驗結(jié)果】
變形桿菌菌體和鞭毛均染成紅色結(jié)果；枯草芽孢桿菌芽孢呈綠色，芽孢囊和菌體為紅色；在藍(lán)紫色背景下，肺炎鏈球菌菌體呈紫色，莢膜無色或淺紫色。
【注意事項】
1.細(xì)菌鞭毛極細(xì)，很容易脫落，操作時必須小心謹(jǐn)慎。
2.供芽孢染色用的菌種應(yīng)控制菌齡。
3.因莢膜為可溶性物質(zhì)，故染色沖洗時動作要輕柔，防止脫離。
【思考題】
1.為什么用油鏡要等標(biāo)本完全干后才能滴加香柏油？
2.如果顯微鏡視野光線太強(qiáng)或者太弱，應(yīng)該怎么調(diào)節(jié)？
3.細(xì)菌涂片過厚對革蘭染色有什么影響？
4.革蘭染色后，如果金黃色葡萄球菌被染成紅色，可能是什么原因造成？
5.細(xì)菌不染色標(biāo)本的檢查有什么實際意義？
6.細(xì)菌特殊染色標(biāo)本的檢查有什么實際意義？
（夏乾峰）

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