第一章轉(zhuǎn)基因技術(shù)概述
　　在自然界，生命的種類(lèi)繁多且復(fù)雜。盡管生命的遺傳性狀在不同種類(lèi)或同種不同個(gè)體間是有差異的，但相對(duì)穩(wěn)定。在特定的條件下，遺傳性狀可因突變、基因轉(zhuǎn)移（genetransfer）等而發(fā)生不同程度的改變。基因轉(zhuǎn)移現(xiàn)象在自然界的生物體中非常常見(jiàn)。在原核細(xì)胞型微生物，基因的轉(zhuǎn)移常采用轉(zhuǎn)化、接合、轉(zhuǎn)導(dǎo)、溶源性轉(zhuǎn)換和原生質(zhì)體融合等方式進(jìn)行，可賦予受體生物新的生物學(xué)性狀，如形態(tài)結(jié)構(gòu)、耐藥性、毒力和抗原性等的改變。而在非細(xì)胞型微生物，如病毒，可發(fā)生病毒基因組之間的重組和重配，或基因產(chǎn)物的互補(bǔ)和表型混合等；此外，部分腫瘤相關(guān)病毒的基因組可以整合到病毒感染的宿主細(xì)胞染色體中，造成宿主細(xì)胞基因組發(fā)生變異，甚至惡性轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)基因技術(shù)，就是基于自然界中常見(jiàn)的基因轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，人為地加以利用，用于不同生命體之間基因轉(zhuǎn)移，尤其是將外源基因轉(zhuǎn)移入真核細(xì)胞，用以研究生命科學(xué)的基本現(xiàn)象和機(jī)制、基因工程產(chǎn)品制備、基因治療、疾病預(yù)防和動(dòng)物模型制備等，為人類(lèi)的健康事業(yè)做出貢獻(xiàn)。
　　一、常見(jiàn)的基因轉(zhuǎn)移方式
　�。ㄒ唬┺D(zhuǎn)化
　　早在1928年，F(xiàn)rederick在研究肺炎鏈球菌時(shí)，昀先報(bào)道了細(xì)菌的轉(zhuǎn)化（transformation）現(xiàn)象。將有莢膜的、菌落呈光滑（S）型的Ⅲ型肺炎鏈球菌注射至小鼠體內(nèi)，小鼠死亡，從死鼠血中可分離到Ⅲ型肺炎鏈球菌。將無(wú)莢膜的、菌落呈粗糙（R）型的Ⅱ型肺炎鏈球菌，或?qū)ⅱ骃型菌加熱殺死后再注射小鼠，則小鼠存活。但如將熱殺死的ⅢS型菌與活的ⅡR型菌混合在一起注射小鼠，則小鼠死亡，并從死鼠血中分離出活的ⅢS型菌。這表明活的ⅡR型菌從死的ⅢS型菌中獲得了產(chǎn)生ⅢS型菌莢膜的遺傳物質(zhì)，使活的ⅡR型菌轉(zhuǎn)化為ⅢS型菌。1944年，Avery等用提取的ⅢS型菌的DNA片段代替熱殺死的ⅢS型菌，與活的ⅡR型菌一起注射小鼠，仍導(dǎo)致小鼠死亡，且從死鼠血中分離到ⅢS型菌。終于證實(shí)引起ⅡR型菌轉(zhuǎn)化的物質(zhì)是ⅢS型菌的DNA。這就是著名的小鼠體內(nèi)肺炎鏈球菌的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。
　　現(xiàn)在，轉(zhuǎn)化因此而被定義為：受體菌直接攝取供體菌游離的DNA片段，并將其整合到自己菌體基因中去，從而使受體菌獲得供體菌新的遺傳性狀的過(guò)程。轉(zhuǎn)化可以分為自然轉(zhuǎn)化和人工轉(zhuǎn)化兩種。自然轉(zhuǎn)化強(qiáng)調(diào)的是細(xì)菌只要處于感受態(tài)（competence）這一特殊的生理狀態(tài)，即可攝取外源的線性染色體DNA分子和質(zhì)粒。感受態(tài)的出現(xiàn)時(shí)間和持續(xù)時(shí)間因菌種而異。除肺炎鏈球菌外，其他細(xì)菌如流感嗜血桿菌、葡萄球菌和芽孢桿菌等均具有自然轉(zhuǎn)化的能力。人工轉(zhuǎn)化則是通過(guò)人為的方法，如低溫CaCl2法誘導(dǎo)細(xì)菌處于感受態(tài)，使細(xì)菌具有攝取DNA的能力，或電穿孔法人為地將DNA導(dǎo)入菌體內(nèi)，為不具有自然轉(zhuǎn)化能力的很多細(xì)菌提供了一條獲取外源DNA的途徑，并且也是目前基因工程的基礎(chǔ)技術(shù)之一。
　�。ǘ�）轉(zhuǎn)導(dǎo)
　　1951年，Joshua和Norton發(fā)現(xiàn)了噬菌體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移方式——轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）。用兩株具不同的多重營(yíng)養(yǎng)缺陷型的鼠傷寒沙門(mén)氏菌混合培養(yǎng)后，基本培養(yǎng)基上長(zhǎng)出原養(yǎng)型菌落，證實(shí)了該菌中存在重組現(xiàn)象。繼續(xù)用Davis的“U”形管實(shí)驗(yàn)證實(shí)這一過(guò)程是否需要細(xì)胞間的直接接觸。“U”形管中間隔有濾板，只允許培養(yǎng)基通過(guò)而細(xì)菌不能通過(guò)。其兩臂裝入完全培養(yǎng)基，將兩株?duì)I養(yǎng)缺陷型菌株分別接種到“U”形管兩臂進(jìn)行培養(yǎng)后，在供體和受體細(xì)菌不接觸的情況下，同樣出現(xiàn)原養(yǎng)型細(xì)菌。表明這一重組過(guò)程并不需要細(xì)菌的直接接觸。仔細(xì)檢查后發(fā)現(xiàn)所用的沙門(mén)氏菌LT22A是攜帶P22噬菌體的溶源性細(xì)菌，另一株是非溶源性細(xì)菌，因此可透過(guò)“U”形管濾板的應(yīng)該是P22噬菌體并進(jìn)行著基因的傳遞。
　　現(xiàn)在，轉(zhuǎn)導(dǎo)被定義為以溫和噬菌體為媒介，將供體菌的DNA片段轉(zhuǎn)移到受體菌內(nèi)，使受體菌獲得新的遺傳性狀的過(guò)程。轉(zhuǎn)導(dǎo)在革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細(xì)菌均可發(fā)生。依據(jù)噬菌體和宿主菌關(guān)系，可把噬菌體分為毒性噬菌體和溫和噬菌體。只有溫和噬菌體能介導(dǎo)細(xì)菌的轉(zhuǎn)導(dǎo)。根據(jù)DNA片段涉及的范圍，轉(zhuǎn)導(dǎo)可分為普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)和局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)兩種。普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)是指噬菌體可以轉(zhuǎn)導(dǎo)供體菌染色體的任何部分到受體菌中；而局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)是指噬菌體只能攜帶前噬菌體整合在染色體兩側(cè)的基因片段到受體菌中。
　�。ㄈ�）轉(zhuǎn)染
　　通常，感染（infection）被定義為病原體通過(guò)自然的途徑進(jìn)入動(dòng)物或人體，突破宿主的防御機(jī)制并引起不同程度的病理過(guò)程。在感染涉及的病原體中，病毒是非常具有特征性的一類(lèi)病原體，屬于非細(xì)胞型微生物，在自然界的分布非常廣泛，可在人、動(dòng)物、植物、昆蟲(chóng)、真菌和原核細(xì)胞型微生物中寄居并引起感染。病毒體積微小，結(jié)構(gòu)非常簡(jiǎn)單，僅含一種類(lèi)型的核酸，因此必須在活細(xì)胞內(nèi)寄生以完成其復(fù)制周期。利用病毒專(zhuān)一性活細(xì)胞寄生及部分病毒整合感染的特點(diǎn)，對(duì)病毒的基因組進(jìn)行分子遺傳學(xué)改造，設(shè)計(jì)出基因工程病毒載體。這種利用病毒載體將外源基因轉(zhuǎn)移入真核細(xì)胞的過(guò)程稱(chēng)轉(zhuǎn)染（transfection），以便與病毒的自然感染過(guò)程相區(qū)別（圖1-1）。近年來(lái)，轉(zhuǎn)染的廣義概念是指外源基因通過(guò)非病毒載體轉(zhuǎn)基因技術(shù)（物理、化學(xué)方法）或病毒載體轉(zhuǎn)基因技術(shù)的方法進(jìn)入真核細(xì)胞的過(guò)程。
　　二、基因轉(zhuǎn)移入真核細(xì)胞的方法
　�。ㄒ唬┗�因轉(zhuǎn)移入真核細(xì)胞的影響因素
　　原核生物如細(xì)菌，為了防止外源DNA的入侵，其體內(nèi)的限制性?xún)?nèi)切核酸酶會(huì)將外源DNA水解成不同的片段，而同時(shí)對(duì)自己的核酸相應(yīng)的酶切位點(diǎn)進(jìn)行甲基化修飾，保護(hù)自己的基因不受自己酶的破壞，這就是細(xì)菌的限制-修飾系統(tǒng)（restriction-modificationsystem）。如果是質(zhì)粒參與的基因轉(zhuǎn)移，依據(jù)質(zhì)粒復(fù)制時(shí)對(duì)宿主的依賴(lài)程度，可分為窄宿主譜質(zhì)粒和寬宿主譜質(zhì)粒；兩種以上的質(zhì)粒在同一宿主中還存在相容性和不相容性的
　　圖1-1野生型病毒的自然感染、病毒載體轉(zhuǎn)染和質(zhì)粒經(jīng)化學(xué)法介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染
　　問(wèn)題，這些因素會(huì)影響質(zhì)粒在宿主菌中的穩(wěn)定性。外源基因進(jìn)入受體菌，必須依賴(lài)RecA蛋白與受體細(xì)菌同源序列之間發(fā)生同源重組；或不依賴(lài)RecA蛋白和同源序列發(fā)生非同源重組，從而讓受體菌獲得新的遺傳性狀。
　　外源基因進(jìn)入真核細(xì)胞的影響因素與上述原核生物有顯著差別。真核細(xì)胞具有不同的膜樣結(jié)構(gòu)，如細(xì)胞膜將細(xì)胞與外環(huán)境隔離開(kāi)來(lái)，只允許特定的物質(zhì)進(jìn)行膜內(nèi)外的交換；細(xì)胞核膜將細(xì)胞核和細(xì)胞內(nèi)環(huán)境隔離開(kāi)來(lái)；細(xì)胞器膜將細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的不同功能空間隔離開(kāi)來(lái)。因?yàn)橥庠椿�因的化學(xué)性質(zhì)是DNA，為大分子質(zhì)量的物質(zhì)，并且對(duì)核酸酶非常敏感。外源基因進(jìn)入真核細(xì)胞，要突破三大障礙因素。首先是必須到達(dá)細(xì)胞膜的表面，其次是如何突破細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，昀后是如何進(jìn)入細(xì)胞核并啟動(dòng)外源基因的表達(dá)。理想的轉(zhuǎn)基因技術(shù)方法必然包括以下幾個(gè)方面：能夠保護(hù)外源基因不被核酸酶降解、能輸送外源基因到達(dá)細(xì)胞膜表面、有利于外源基因跨過(guò)細(xì)胞膜并促進(jìn)其進(jìn)入細(xì)胞核。
　�。ǘ�）外源基因轉(zhuǎn)移入真核細(xì)胞的類(lèi)型和方法
　　外源基因進(jìn)入真核細(xì)胞的類(lèi)型包括質(zhì)粒型載體和病毒顆粒型載體兩類(lèi)，后者即病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，可分為假型病毒載體和重組型病毒載體兩種。
　　質(zhì)粒型載體是將外源基因克隆入含有真核細(xì)胞（病毒）復(fù)制子的真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒，既可在大腸桿菌中傳代，也能在允許真核細(xì)胞中以染色體外質(zhì)粒的形式復(fù)制和表達(dá)外源基因，但不會(huì)產(chǎn)生感染性病毒顆粒。對(duì)于這種類(lèi)型的載體進(jìn)入真核細(xì)胞，常用物理（表1-1）和化學(xué)的方法（表1-2）。
　　表1-1介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移常用的物理方法
　　物理方法原理材料DNA用量?jī)?yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)
　　傳統(tǒng)的針頭注射外力注射器高便宜、簡(jiǎn)單，便于效率比較低應(yīng)用于臨床
　　顯微注射細(xì)胞內(nèi)注射DNA顯微鏡和顯微注低適用于細(xì)胞水平步驟煩瑣，不適用射針的研究，不易降解于臨床，專(zhuān)業(yè)技術(shù)要求高
　　粒子轟擊高壓氣體使微小不同的加速裝置低對(duì)靶組織有很高需要很多的設(shè)備和的載體加速的效率步驟
　　電穿孔電脈沖 電穿孔儀低高轉(zhuǎn)染效率未得到廣泛認(rèn)可
　　流體動(dòng)力學(xué)流體動(dòng)力學(xué)的力量特殊的注射器中等簡(jiǎn)單易于使用、轉(zhuǎn)組織局限性染效率高
　　包裹微球膠囊化的微球包中等控制下投遞和釋放制備的質(zhì)量控制裹DNA
　　超聲超聲儀超聲超聲儀中等偏低安全、組織損傷小技術(shù)不斷發(fā)展、經(jīng)驗(yàn)有限
　　表1-2介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移常用的化學(xué)方法
　　公司 產(chǎn)品組成
　　Amersham-BiosciencesCellPhecttransfectionKitCaPO4orDEAE-DextranBio-RadLabsCytoFecteneTransfectionReagentCationiclipidBDBiosciences-CLOMTECHCLONfectinTMCationiclipid
　　CalPhosTMCalciumphosphateCPGInc.GeneLimoTMTransfectionReagentPlusPolycationiclipids+lipidcompoundGeneLimoTMTransfectionReagentPolycationiclipids+lipidcompoundSuper
　　GeneTherapySystems GenePORTERTMDOPE+ProprietarycompoundsGenePORTERTM2ProprietarymaterialBoosterExpressTMReagentKitProprietarymaterialPGeneGripTMVector/TransfectionGenePORTER+plasmidvector
　　SystemsGlenResearchCytofectinGSCationiclipid
　　續(xù)表
　　公司產(chǎn)品組成
　　InvitrogenLipofectAMINE2000TMReagentPolycationiclipid
　　LipofectAMINEPLUSTMReagentPolycationiclipid（DOSPA：DOPE）
　　LipofECTIN.ReagentCationiclipid（DOSPA：DOPE）
　　TransfectionReagentOptimizationSystemLipofectAMINEPLUSTM+Lipofectin.+CellFectin.+DMRIE
　　CellFectin.ReagentCationiclipopolyamine
　　OligofectAMINETMReagentProprietary
　　InvivoGenLipoVecTMCationicphosphonolipids
　　LipoGenTMNon-liposomallipid
　　MBIFermentasExGen500Cationicpolymer
　　ExGen500invivodeliveryagentCationicpolymer
　　NovagenGeneJuiceTMTransfectionReagentProprietarypolyamine
　　PanVeraCorporationTransⅡ.-TKOReagentsPolyamine.
　　TransⅡ.-LT-1andLT-2Polyamine.
　　TransⅡ.ExpressTransfectionReagentPolyamine.
　　TransⅡ.PanPackPolyamine+cationiclipid.
　　TransⅡ.-InsectaCationiclipid.
　　TransⅡ.-293Polyamine.
　　TransⅡ.-KeratinocytePolyamine
　　PromegaTransFASTTMTransfectionReagentCationiclipid
　　TfxTM-10，-20，and-50ReagentsCationiclipid
　　TfxTMReagentsTransfectionTrioCationiclipid
　　Transfectam.ReagentCationiclipid
　　ProFection.MammalianTransfectionDEAE-Destranorcalciumphosphate
　　System
　　QbiogeneGeneSHUTTLETM-20and-40ReagentsPolycationiclipids
　　InvivoGeneSHUTTLETMReagentLiposome-mediatedDOTAP：Chol.
　　DuoFectTMReage

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