本書主要闡述了基因、工具酶、載體、重組DNA分子的轉(zhuǎn)化與重組子篩選、大腸桿菌基因工程、酵母菌基因工程、核酸的分離純化與目的基因的克隆、基因組、蛋白質(zhì)工程和途徑工程等內(nèi)容。
本書的特色：①講解了基因和基因組;②重點(diǎn)講述了原核微生物的代表——大腸桿菌和真核微生物的代表——酵母菌的基因工程;③簡(jiǎn)要介紹了第二代基因工程——蛋白質(zhì)工程和第三代基因工程——途徑工程;④介紹了實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的注意事項(xiàng)和實(shí)例，在附錄中羅列了一些補(bǔ)充內(nèi)容;⑤詳細(xì)講述了三代DNA測(cè)序和多種基因組定點(diǎn)編輯(同源重組、RecET/Red重組系統(tǒng)、ZFN、TALEN和CRISPRCas系統(tǒng))的原理;⑥詳細(xì)講述了分離純化核酸與克隆基因的基本原理。
本書是針對(duì)生物工程專業(yè)的本科生編寫的教材，可供生物技術(shù)和生物科學(xué)專業(yè)的本科生使用，也可供研究生和有關(guān)科研人員參考。
1973年，美國(guó)的科恩(S.Cohen)等將體外重組的DNA分子導(dǎo)入到大腸桿菌進(jìn)行了復(fù)制，從此拉開了基因工程的序幕�；蚬こ淘谶^(guò)去的40多年中以驚人的速度飛速發(fā)展，其應(yīng)用成果已經(jīng)滲透到農(nóng)業(yè)、工業(yè)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、國(guó)防、能源和環(huán)保等諸多領(lǐng)域，成為生物學(xué)中發(fā)展速度快、創(chuàng)新成果多、應(yīng)用前景廣的一門核心技術(shù)�；蚬こ陶n也已成為國(guó)內(nèi)外高校生物工程(bioengineering)、生物技術(shù)(biotechnology)和生物科學(xué)(bioscience)專業(yè)本科生的一門專業(yè)主干課程。
基因工程是以遺傳學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)等學(xué)科為基礎(chǔ)，引入工程學(xué)的一些概念，通過(guò)周密的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)操作，高效率地達(dá)到預(yù)期的目標(biāo)。為了配合高等學(xué)�；蚬こ痰慕虒W(xué)，并促進(jìn)我國(guó)生物工程、生物技術(shù)相關(guān)專業(yè)人才的培養(yǎng)，特此編寫了這部教材。本書具有以下幾個(gè)特色。
�、俳逃康纳锕こ虒I(yè)(083001)本科教學(xué)質(zhì)量國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中要求基因工程課程為32學(xué)時(shí)，而很多高校的生物工程專業(yè)不講授遺傳學(xué)，且分子生物學(xué)的學(xué)時(shí)短，因此在基因工程中有必要講解基因和基因組的相關(guān)內(nèi)容，從而為學(xué)生今后的學(xué)習(xí)和應(yīng)用奠定堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。
�、陂_設(shè)生物工程的高校主要是工科院校，而他們多以微生物作為研究對(duì)象，因此重點(diǎn)講述了原核微生物的代表——大腸桿菌和真核微生物的代表——酵母菌的基因工程。
�、酆�(jiǎn)要介紹了第二代基因工程——蛋白質(zhì)工程(有時(shí)稱為DNA誘變)和第三代基因工程——途徑工程，為遺傳育種工作打下理論基礎(chǔ)。
�、茉诿總�(gè)基因操作單元都介紹了實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的注意事項(xiàng)，大腸桿菌和酵母菌的基因工程里列舉了實(shí)例，在附錄中羅列了細(xì)菌和酵母的遺傳命名指南、常見的克隆方法、工具酶和PCR的相關(guān)問(wèn)答等內(nèi)容。
⑤在基因組中詳細(xì)講述了三代DNA測(cè)序和多種基因組定點(diǎn)編輯(同源重組、RecET/Red重組系統(tǒng)、ZFN、TALEN和CRISPRCas系統(tǒng))的原理，為遺傳育種工作奠定了理論基礎(chǔ)。
�、拊敿�(xì)講述了分離純化核酸與克隆基因的基本原理。
編者希望本書能夠成為生物工程專業(yè)本科生的教科書，并能夠成為生物技術(shù)和生物科學(xué)專業(yè)本科生和相關(guān)專業(yè)研究生、工作者的參考書。
在編寫過(guò)程中編者參考了一些前人的成果與論述，同時(shí)也得到了許多朋友和家人的支持，在此表示衷心的感謝！
河北工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院的成文玉為本書繪制插圖出力不少，在此表示衷心感謝！
編者懷著一種為基因工程的教學(xué)工作盡心盡力的心情編寫了本書。但是，編者的水平有限，加之時(shí)間倉(cāng)促，書中難免存在疏漏之處，懇請(qǐng)讀者和同行批評(píng)指正！
編者
2016年春于北運(yùn)河畔
第1章緒論1
1.1基因工程的基本概念1
1.2基因工程的理論和技術(shù)1
1.2.1基因工程所依賴的核心理論1
1.2.2基因工程所依賴的核心技術(shù)2
1.3基因工程的建立與發(fā)展2
1.3.1基因工程的建立2
1.3.2基因工程的發(fā)展3
1.4基因工程的產(chǎn)業(yè)化及應(yīng)用6
1.4.1產(chǎn)業(yè)化6
1.4.2基因工程的應(yīng)用7
1.5轉(zhuǎn)基因生物的安全性與倫理9
1.5.1轉(zhuǎn)基因生物的安全性9
1.5.2轉(zhuǎn)基因生物的倫理11
1.6應(yīng)用事例12
1.6.1問(wèn)題的提出12
1.6.2生化產(chǎn)品生產(chǎn)中存在的問(wèn)題12
1.6.3基因工程的用途13
1.6.4實(shí)例13
第2章基因14
2.1“遺傳因子”——生物性狀遺傳的符號(hào)14
2.2基因——位于染色體上的遺傳功能單位14
2.2.1等位基因14
2.2.2復(fù)等位基因15
2.3順反子——一個(gè)基因一條多肽17
2.4操縱子——遺傳信息傳遞和表達(dá)的統(tǒng)一體18
2.5超基因20
2.6假基因21
2.7斷裂基因22
2.7.1RNA剪接22
2.7.2內(nèi)含子的類型24
2.8重疊基因27
2.9可動(dòng)基因29
2.9.1Ac-Ds系統(tǒng)29
2.9.2插入序列29
2.9.3轉(zhuǎn)座子31
2.9.4P因子34
2.9.5反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子35
2.10癌基因和抑癌基因36
2.11染色體外基因37
2.11.1質(zhì)粒37
2.11.2線粒體基因37
2.11.3葉綠體基因39
2.11.4非孟德爾遺傳39
第3章工具酶41
3.1限制性核酸內(nèi)切酶41
3.1.1宿主的限制和修飾現(xiàn)象41
3.1.2限制性核酸內(nèi)切酶的類型42
3.1.3限制性核酸內(nèi)切酶的命名46
3.1.4影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素46
3.1.5限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)DNA的消化作用48
3.1.6限制性核酸內(nèi)切酶反應(yīng)的終止49
3.1.7限制性核酸內(nèi)切酶酶切反應(yīng)的操作步驟和注意事項(xiàng)49
3.2DNA聚合酶50
3.2.1DNA聚合酶Ⅰ(E.coli)51
3.2.2大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段52
3.2.3T4DNA聚合酶52
3.2.4依賴于RNA的DNA聚合酶53
3.2.5T7DNA聚合酶53
3.2.6修飾的T7DNA聚合酶53
3.3DNA連接酶54
3.3.1大腸桿菌和T4噬菌體的DNA連接酶54
3.3.2影響連接反應(yīng)的因素55
3.3.3DNA片段在體內(nèi)和體外的連接——黏性末端的連接55
3.3.4平齊末端的連接57
3.3.5連接反應(yīng)的注意事項(xiàng)59
3.4DNA及RNA的修飾酶59
3.4.1末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶59
3.4.2T4多核苷酸激酶60
3.4.3堿性磷酸酶61
3.5核酸外切酶61
3.5.1核酸外切酶Ⅶ62
3.5.2核酸外切酶Ⅲ62
3.5.3λ核酸外切酶和T7基因6核酸外切酶63
3.6單鏈核酸內(nèi)切酶63
3.6.1S1核酸酶63
3.6.2Bal31核酸酶64
3.7細(xì)胞裂解酶65
3.7.1溶菌酶65
3.7.2蛋白酶K65
3.7.3纖維素酶65
3.7.4其他裂解酶66
3.8其他66
3.8.1瓊脂糖酶66
3.8.2核酸酶抑制劑66
第4章載體67
4.1質(zhì)粒載體67
4.1.1質(zhì)粒的一般生物學(xué)特性67
4.1.2質(zhì)粒載體的選擇71
4.1.3常用的大腸桿菌質(zhì)粒載體72
4.2噬菌體載體79
4.2.1單鏈?zhǔn)删w載體80
4.2.2雙鏈?zhǔn)删w載體83
4.3柯斯質(zhì)粒載體89
4.3.1柯斯質(zhì)粒載體的組成89
4.3.2柯斯質(zhì)粒載體的特點(diǎn)89
4.3.3柯斯質(zhì)粒載體的應(yīng)用90
4.4噬菌粒載體91
4.4.1噬菌粒載體的概念91
4.4.2pUC118和pUC119噬菌粒載體92
4.4.3pBluescript噬菌粒載體92
4.5人工染色體載體93
4.5.1酵母人工染色體載體93
4.5.2細(xì)菌人工染色體載體95
4.5.3P1人工染色體載體96
第5章重組DNA分子的轉(zhuǎn)化與重組子篩選98
5.1DNA分子的轉(zhuǎn)化與擴(kuò)增98
5.1.1DNA重組轉(zhuǎn)化的基本概念98
5.1.2受體細(xì)胞的選擇99
5.1.3轉(zhuǎn)化方法101
5.1.4轉(zhuǎn)化率及其影響因素104
5.1.5轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴(kuò)增105
5.1.6進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)的注意事項(xiàng)105
5.2重組體克隆的篩選與鑒定105
5.2.1遺傳檢測(cè)法106
5.2.2物理檢測(cè)法110
5.2.3核酸雜交法112
5.2.4PCR檢測(cè)法115
5.2.5克隆基因定位法115
5.2.6測(cè)序檢測(cè)法117
5.2.7外源基因表達(dá)產(chǎn)物檢測(cè)法117
第6章大腸桿菌基因工程120
6.1外源基因在大腸桿菌高效表達(dá)的原理120
6.1.1啟動(dòng)子120
6.1.2終止子125
6.1.3核糖體結(jié)合位點(diǎn)126
6.1.4密碼子127
6.1.5質(zhì)粒拷貝數(shù)128
6.2大腸桿菌工程菌的構(gòu)建策略130
6.2.1包涵體型異源蛋白的表達(dá)130
6.2.2分泌型異源蛋白的表達(dá)133
6.2.3融合型異源蛋白的表達(dá)135
6.2.4寡聚型異源蛋白的表達(dá)138
6.2.5整合型異源蛋白的表達(dá)142
6.2.6蛋白酶抗性或缺陷型表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建143
6.3重組異源蛋白的體外復(fù)性活化145
6.3.1蛋白質(zhì)變性的動(dòng)力學(xué)原理145
6.3.2折疊中間狀態(tài)分子的集聚作用146
6.3.3包涵體的溶解與變性147
6.3.4異源蛋白的復(fù)性與重折疊149
6.4基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性及其對(duì)策154
6.4.1基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)與機(jī)制155
6.4.2改善基因工程菌不穩(wěn)定性的策略156
6.5大腸桿菌基因工程的案例158
第7章酵母菌基因工程163
7.1酵母菌的宿主系統(tǒng)163
7.1.1提高重組蛋白表達(dá)產(chǎn)率的突變宿主菌163
7.1.2抑制超糖基化作用的突變宿主菌164
7.1.3減少泛素依賴型蛋白降解作用的突變宿主菌164
7.1.4內(nèi)源性蛋白酶缺陷型的突變宿主菌165
7.2酵母菌的載體系統(tǒng)166
7.2.1釀酒酵母的2μ環(huán)狀質(zhì)粒166
7.2.2乳酸克魯維酵母的線型質(zhì)粒167
7.2.3果蠅克魯維酵母的環(huán)狀質(zhì)粒168
7.2.4含ARS的YRp和YEp169
7.2.5含CEN的YCp169
7.2.6穿梭載體170
7.3酵母菌的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)171
7.3.1酵母菌的轉(zhuǎn)化程序172
7.3.2轉(zhuǎn)化質(zhì)粒在酵母細(xì)胞中的命運(yùn)172
7.3.3用于轉(zhuǎn)化子篩選的標(biāo)記基因173
7.4酵母菌的表達(dá)系統(tǒng)175
7.4.1酵母菌啟動(dòng)子的基本特征與選擇175
7.4.2酵母菌啟動(dòng)子的可調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)176
7.4.3外源基因在酵母菌中表達(dá)的限制因素178
7.4.4酵母菌表達(dá)系統(tǒng)的選擇178
7.5酵母菌基因工程的案例180
第8章核酸的分離純化與目的基因的克隆184
8.1核酸的分離純化184
8.1.1核酸分離提取的原則184
8.1.2核酸的分離提取185
8.1.3質(zhì)粒DNA的提取188
8.1.4RNA的提取189
8.1.5核酸的檢測(cè)190
8.2目的基因的克隆192
8.2.1鳥槍法192
8.2.2cDNA法195
8.2.3PCR擴(kuò)增法198
8.2.4化學(xué)合成法208
8.2.5基因文庫(kù)的構(gòu)建210
第9章基因組214
9.1基因組剖析214
9.1.1基因組序列復(fù)雜性214
9.1.2原核生物基因組216
9.1.3真核生物基因組220
9.2基因組測(cè)序227
9.2.1DNA測(cè)序方法227
9.2.2基因組測(cè)序234
9.2.3序列組裝236
9.3基因組序列注釋239
9.3.1搜尋基因239
9.3.2基因注釋246
9.3.3基因功能檢測(cè)248
9.3.4高通量基因功能研究方法249
9.4功能基因組學(xué)251
9.4.1組學(xué)簡(jiǎn)介251
9.4.2轉(zhuǎn)錄物組251
9.4.3蛋白質(zhì)組252
9.4.4基因本體253
9.5基因組表觀遺傳256
9.5.1什么是表觀遺傳256
9.5.2位置效應(yīng)258
9.5.3DNA甲基化259
9.5.4染色體重建259
9.6基因組編輯260
9.6.1遺傳重組260
9.6.2基因敲除265
9.6.3新一代的基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)269
第10章蛋白質(zhì)工程282
10.1蛋白質(zhì)工程的基本概念282
10.1.1蛋白質(zhì)工程的基本特征282
10.1.2蛋白質(zhì)工程的研究?jī)?nèi)容和應(yīng)用283
10.1.3蛋白質(zhì)工程實(shí)施的必要條件283
10.2基因的體外定向突變284
10.2.1局部隨機(jī)摻入法284
10.2.2堿基定點(diǎn)轉(zhuǎn)換法285
10.2.3部分片段合成法286
10.2.4引物定點(diǎn)引入法287
10.2.5PCR擴(kuò)增突變法289
10.3基因的體外定向進(jìn)化290
10.3.1易錯(cuò)PCR291
10.3.2DNA改組291
10.3.3體外隨機(jī)引發(fā)重組291
10.3.4交錯(cuò)延伸292
10.3.5過(guò)渡模板隨機(jī)嵌合生長(zhǎng)292
10.3.6漸增切割雜合酶生成294
10.3.7同源序列非依賴性蛋白質(zhì)重組295
10.3.8突變文庫(kù)的篩選模型296
10.4蛋白質(zhì)工程的設(shè)計(jì)思想與應(yīng)用297
10.4.1提高蛋白質(zhì)或酶的穩(wěn)定性297
10.4.2減少重組多肽鏈的錯(cuò)誤折疊297
10.4.3改善酶的催化活性297
10.4.4消除酶的被抑制特性297
10.4.5修飾酶的催化特異性298
10.4.6強(qiáng)化配體與其受體的親和性298
第11章途徑工程299
11.1途徑工程的基本概念299
11.1.1途徑工程的基本定義299
11.1.2途徑工程的基本過(guò)程300
11.1.3途徑工程的基本原理302
11.2途徑工程的研究戰(zhàn)略303
11.2.1在現(xiàn)存途徑中提高目標(biāo)產(chǎn)物的代謝流303
11.2.2在現(xiàn)存途徑中改變物質(zhì)流的性質(zhì)304
11.2.3利用已有途徑構(gòu)建新的代謝旁路305
11.3初級(jí)代謝的途徑工程305
11.3.1發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的基本戰(zhàn)略306
11.3.2酵母菌屬乙醇發(fā)酵途徑的改良308
11.3.3高產(chǎn)乙醇的重組大腸桿菌的構(gòu)建309
11.3.4直接利用太陽(yáng)能合成乙醇的光合細(xì)菌途徑設(shè)計(jì)311
11.4次級(jí)代謝的途徑工程312
11.4.1提高次級(jí)代謝產(chǎn)物的手段312
11.4.2紅霉素(聚酮類抗生素)的生物合成313
11.4.3提高紅霉素A產(chǎn)量的策略315
附錄318
參考文獻(xiàn)336
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