第一章　緒　　論
<br>第一節(jié)　工業(yè)微生物育種在生物發(fā)酵產業(yè)中的地位
<br>　　工業(yè)微生物菌種選育在生物發(fā)酵產業(yè)中占有重要地位，是決定該發(fā)酵產品能否具有工業(yè)
<br>化價值及發(fā)酵過程成敗與否的關鍵�，F代發(fā)酵工業(yè)之所以如此迅猛發(fā)展，除了發(fā)酵工藝改進
<br>和發(fā)酵設備更新之外，更重要的是由于進行了菌種的選育及其改良，為發(fā)酵工藝提供了人類需
<br>要的各種類型的突變菌株，從而使抗生素、酶制劑、氨基酸、有機酸、維生素、核苷酸、激素、色
<br>素、生物堿、不飽和脂肪酸以及其他生物活性物質等產品的產量成倍，甚至成千倍地增長，同時
<br>產品的質量也不斷提高。因此，工業(yè)微生物育種對于提高生物發(fā)酵產業(yè)產品的產量和質量，進
<br>一步開發(fā)利用微生物資源，增加生物發(fā)酵產業(yè)產品的品種具有重大意義。
<br>用于工業(yè)生產的微生物菌種要具有以下特性。
<br>（1） 在遺傳上必須是穩(wěn)定的。
<br>（2） 易于產生許多營養(yǎng)細胞、孢子或其他繁殖體。
<br>（3） 必須是純種，不應帶其他雜菌及噬菌體。
<br>（4） 種子的生長必須旺盛、迅速。
<br>（5） 產生所需要的產物時間短。
<br>（6） 比較容易分離提純。
<br>（7） 有自身保護機制，抵抗雜菌污染能力強。
<br>（8） 能保持較長的良好經濟性能。
<br>（9） 菌株對誘變劑處理較敏感，從而可能選育出高產菌株。
<br>（10） 在規(guī)定的時間內，菌株必須產生預期數量的目的產物，并保持相對地穩(wěn)定。
<br>具備以上條件的菌株，才能保證發(fā)酵產品的產量和質量，這是發(fā)酵工業(yè)的最大目的和最低
<br>要求。野生型菌株是不可能具備上述條件的，必須通過對野生型菌株的選育才能實現。發(fā)酵
<br>工業(yè)為人們提供了各種各樣的發(fā)酵產品，而工業(yè)微生物育種為發(fā)酵工業(yè)的上述貢獻奠定了必
<br>不可少的基礎。
<br>第二節(jié)　工業(yè)微生物育種的進展
<br>工業(yè)微生物育種，無論從自然變異中選擇或是人工誘變的選擇，都是建立在遺傳和變異的
<br>基礎上。遺傳和變異是生物界生命活動的基本屬性之一。沒有變異，生物界就失去進化的素
<br>材；而沒有遺傳，變異也無法積累。同樣，就優(yōu)良菌株的選育來講，沒有變異就沒有選擇的素
<br>材；沒有遺傳，選到的優(yōu)良性狀也不能進行培育。由此可見，工業(yè)微生物育種學是建立在微生
<br>物遺傳學基礎上，而兩者是相輔相成的。
<br>微生物本身，在漫長的進化過程中，逐漸達到適合于它的生存和繁衍的水平。野生型微生
<br>物經自然選擇，能適應它的周圍環(huán)境，能適應同其他物種的競爭，但卻不能按照人的意志生產
<br>人們需要的物質。因此，從人類的利益出發(fā)，必須對工業(yè)微生物菌種進行改良，使之產生數量
<br>遠遠超出微生物本身需要的物質，或者不是它正常產生的新物質。
<br>對工業(yè)微生物菌種進行有目的的改良，是在有關微生物遺傳學知識被人們了解并掌握之
<br>后才成為可能的。同時，這種改良涉及多學科領域。
<br>1927 年，人們發(fā)現了X 射線誘發(fā)突變。1945 年后，各種具有誘變能力的輻射和化學誘變
<br>劑的發(fā)現，為這種改良提供了非常有用的工具。通過誘變和篩選的“隨機選擇” ，不僅在提高現
<br>有產品的發(fā)酵單位上發(fā)揮了巨大作用，而且在當前多種新發(fā)酵產品的改進方面也具有很大潛
<br>力。通過對誘變作用和DNA 修復機制的深入了解，可以設計出所希望的突變型的最佳方案。
<br>對基因表達和代謝途徑調控機制的進一步闡明，可以設計出使所需要的突變特性得以充分表
<br>達的篩選條件。自動儀表裝置和微機的應用，則可使單位時間內獲得分離的菌株數量大大增
<br>加。這些技術的綜合應用，使獲得優(yōu)良菌株的概率大為提高。
<br>工業(yè)微生物育種技術的發(fā)展大致經歷如下階段。
<br>隨著微生物學的發(fā)展，特別是發(fā)明微生物純種培養(yǎng)法之后，開始了微生物純種的自然
<br>選育，對工業(yè)微生物育種有很大的影響。當時，在酒精發(fā)酵中，推廣了自然選育的純系良
<br>種，扭轉了酒精生產不穩(wěn)定的現象。這是最早應用微生物遺傳學原理于微生物育種實踐而
<br>提高發(fā)酵產物水平的一個成功實例。自然選育方法雖已沿用多年，迄今仍是工業(yè)微生物育
<br>種的手段之一。
<br>由于自然突變頻率低，單純依賴自然界存在的微生物群體來進行的自然選育無疑有很大
<br>局限性。繼而進行了人工誘變選育，取得了很大效果。
<br>20 世紀40 年代初，Beadle 和Tatum 采用X 射線和紫外線等輻射因子來誘變紅色面包
<br>霉等，獲得了各種代謝障礙的變株，并于1941 年提出“一個基因一種酶”的學說，闡述基因
<br>與酶功能的直接關系，使遺傳學從細胞水平發(fā)展到分子水平，促進了工業(yè)微生物育種技術
<br>的發(fā)展。
<br>誘變育種是以人工誘變基因突變?yōu)榛�礎的，過去是工業(yè)微生物育種的主要方法，至今仍是
<br>世界各國行之有效的重要方法，尤其發(fā)酵工業(yè)中的各種優(yōu)良高產菌株絕大部分都是以誘變育
<br>種方法獲得的。例如，抗生素生產中的青霉素產生菌特異青霉（ Penicilliumnotatum）是1929
<br>年英國的Flemirlg 發(fā)現的。當時表層培養(yǎng)只有1～2 U/ml ，而1943年美國北部地區(qū)研究所實
<br>驗室分離出產黃青霉（ Pen.chrysogenum）NRRL9551 同時伴以沉沒培養(yǎng)成功，則達到20U/ ml，在
<br>此基礎上，經過40 多年的誘變育種，到目前已達80 000 U/ml 以上，比原始菌株的產量提高了
<br>上千倍。至于其他抗生素品種，如鏈霉素、土霉素、四環(huán)素、紅霉素及灰黃霉素等，都由原來的
<br>幾十單位提高到目前的幾萬單位。
<br>除抗生素外，其他許多重要發(fā)酵產品也都由于進行了有效的菌種選育工作，在產量和質量
<br>上都取得明顯的提高，其主要手段也都是誘變育種。
<br>但是，某一菌株長期使用誘變劑處理之后，除產生誘變劑“疲勞效應”外，還會引起菌種生
<br>長周期的延長、孢子量減少、代謝減慢等，這對發(fā)酵工藝的控制是不利的。而雜交育種可以作
<br>為育種的另一手段，其成功不僅表現在種內雜交上，而且在種間雜交以至屬間雜交都取得令人
<br>滿意的結果。
<br>雜交育種的最主要目的是把不同菌株的優(yōu)良經濟性狀集中于重組體中，克服長期用誘變
<br>劑處理造成的上述缺陷，同時雜交還是增加產品新品種的手段之一。當然，雜交育種也應當建
<br>立在誘變育種的基礎上，沒有誘變育種，雜交菌株的產量是難以繼續(xù)提高的。
<br>代謝控制育種以20 世紀50 年代末谷氨酸發(fā)酵取得成功使發(fā)酵工業(yè)進入第三轉折期――
<br>代謝控制發(fā)酵時期，并在其后的年代里得到飛躍的發(fā)展。
<br>代謝控制育種活力在于以誘變育種為基礎，獲得各種解除或繞過了微生物正常代謝途徑
<br>的突變株，從而人為地使有用產物選擇性地大量生成和累積。代謝控制育種的崛起標志著誘
<br>變育種發(fā)展到理性階段，導致了氨基酸、核苷酸及某些次級代謝產物的高產菌株大批地投入
<br>生產。
<br>隨著基因工程在工業(yè)微生物菌種選育中的應用，世界上以基因工程方法創(chuàng)造的各種工程
<br>菌不計其數，實現了人為的菌種選育，一切可以按照人們事先設計和控制的方法進行育種，這
<br>是一種最新的育種技術。
<br>基因工程菌的構建和應用，已在多方面顯示出其巨大的生命力。通過基因工程的方法生
<br>產藥物―― 已獲得包括治療用藥物、疫苗、單克隆抗體及診斷試劑等多種獲得上市的品種；通
<br>過基因工程方法提高菌株生產能力―― 已獲得包括氨基酸類、工業(yè)用酶制劑及頭孢霉素C 在
<br>內的工程菌；通過基因工程方法改造傳統(tǒng)發(fā)酵工藝―― 如氧傳遞有關的血紅蛋白基因克隆到
<br>遠青鏈霉菌，降低了對氧的敏感性；通過基因工程方法提高菌種抗性等。以上諸多類型的基因
<br>工程菌構建，使工業(yè)微生物育種突破了傳統(tǒng)的、經典的育種模式，在工業(yè)微生物育種中展示了
<br>極為光明的前景。
<br>基因組改組（genome shuffing）是一種細胞定向進化技術。2002 年Zhang 等在Nature
<br>上首次發(fā)表了微生物基因組改組育種報道�；�因組改組是多親本微生物之間發(fā)生重組，先用
<br>誘發(fā)突變或點突變技術產生復雜子代組合庫，再利用改組技術將有利性狀組合拼接，快速進化
<br>目標菌的一種選育微生物的新方法。
<br>基因組改組技術巧妙地模擬和發(fā)展了自然進化過程，以分子進化為核心，用工程學原理加
<br>以人工設計，在實驗室實現微生物全細胞快速定向進化，僅需1～2 年就可完成自然界數百萬
<br>年才能達到的進化目標，使得人們能夠在較短的時間內獲得性狀大幅度改良的正向突變的目
<br>標菌株，成為微生物育種的前沿技術。
<br>分子定向進化（directed molecular evolution）是一種DNA水平的分子定向進化技術。20
<br>世紀90 年代中期美國Arnold 和Stemmer 首先報道了蛋白質（酶）分子改造成功的例子，從此
<br>拉開了酶蛋白分子定向進化育種的序幕。分子定向進化屬于蛋白質（酶）非理性設計的主要范
<br>疇，它不需要了解蛋白質的空間結構和催化機制，在實驗室中人為創(chuàng)造特殊的進化條件，模擬
<br>自然進化機制，在體外進行酶蛋白基因的改造，并定向篩選出所需特性的突變蛋白。這樣就能
<br>在較短時間內完成漫長的自然進化過程，甚至可以在幾個月或幾周的時間內創(chuàng)造出優(yōu)化的酶
<br>蛋白，而在自然的進化過程中，要得到這個結果需要幾千萬年之久。
<br>高通量篩選（high唱throughputscreening）是微生物育種技術的重要組成部分，在工業(yè)微生
<br>物育種過程中，無論是傳統(tǒng)的誘變育種、雜交育種、基因組改組育種、現代基因工程育種及分子
<br>定向進化育種等，建庫后，都要對文庫進行篩選。而文庫的庫容量很大，各個樣品的質量參差
<br>不齊，具有很大的隨機性。使用傳統(tǒng)零敲碎打的篩選方法，篩選量低，概率小，工作量大，要耗
<br>費大量的人力、物力。在這種背景下，高通量篩選技術孕育而生。
<br>高通量篩選技術的核心，首先必須根據目的樣品的特性，開發(fā)出合適的篩選模型，將樣品
<br>的這些特性轉化成可以用攝像頭和計算機傳感器識別的光信號或者電信號。此外，要有自動
<br>化或者自動化的實驗操作系統(tǒng)，能夠進行移液、接種、清洗等設備操作。而且必須具備以下特
<br>點：具有在高潔凈度下工作的能力，不引起污染，可多通道一次性進行多組操作，操作速度快，
<br>具有良好的軟件和硬件兼容性，能與監(jiān)測設備對接，實驗數據可以在多種軟件平臺上進行分
<br>析，能使用各種通用型規(guī)格的耗材。
<br>隨著工業(yè)微生物育種技術的不斷創(chuàng)新，尤其分子育種的手段與方法有了嶄新的進展，極大
<br>地豐富了工業(yè)微生物育種的內容。
<br>在工業(yè)微生物生產菌種基因的表達系統(tǒng)方面，除了最早采用的原核表達系統(tǒng)和隨后采用
<br>的酵母表達系統(tǒng)外，還實現了絲狀真菌表達系統(tǒng)和哺乳動物細胞表達系統(tǒng)，為工業(yè)微生物工程
<br>菌的構建創(chuàng)造了創(chuàng)新性的技術基礎。
<br>為提高工業(yè)微生物生產菌株的產量，重組載體誘變方法已得以實現，其中質粒直接誘變可
<br>通過化學誘變劑與質粒反應時間的長短來控制突變率，篩選目的突變菌株已有成功實例。
<br>基因敲除是通過一定的途徑使機體特定的基因失活或缺失的一種分子生物學方法，它具
<br>有定位性強、插入基因隨染色體DNA 穩(wěn)定遺傳、操作方便等優(yōu)點。它為定向改造工業(yè)微生物
<br>品種提供了重要的技術支撐。筆者在闡明芳香族氨基酸代謝途徑的基礎上，通過敲除L唱色氨
<br>酸菌株的tyrA 基因獲得了酪氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株，應用這種營養(yǎng)缺陷型，可使代謝支路的中
<br>間體預苯酸不流向酪氨酸生成的方向，使色氨酸的合成有充足的原料。發(fā)酵試驗結果顯示：工
<br>程菌的發(fā)酵液中沒有酪氨酸的存在，同時L唱色氨酸的產量較原始菌株提高近1 倍，同樣，該技
<br>術也在L唱苯丙氨酸的工程菌構建中取得成功。
<br>全局轉錄機器工程育種是一種通過引入全局轉錄擾動來獲得多尺度細胞表型突變庫的新
<br>方法，可以快速、高效地獲得性能顯著提升的細胞表型重要新技術。
<br>工業(yè)微生物高密度培養(yǎng)，又稱高細胞密度發(fā)酵技術，是在傳統(tǒng)發(fā)酵技術上改進的發(fā)酵技
<br>術，利用一定的培養(yǎng)技術和裝置，極大地改進了發(fā)酵工藝，使菌體密度較普通培養(yǎng)有顯著提高，
<br>增加工程菌對數期的生長時間、相對縮短衰亡時間來提高菌體的發(fā)酵密度，最終提高產物的比
<br>生產率，不僅可減少培養(yǎng)體積，強化下游分離提取，還可以縮短生產周期，減少設備投資從而降
<br>低生產成本，極大地提高市場競爭力。
<br>工業(yè)微生物工程菌構建成功之后，關鍵還在于如何在特定的裝備條件下，使其目的產物高
<br>效表達最大化，其中工業(yè)微生物工程菌的培養(yǎng)基優(yōu)化是使該工程菌株高產性狀及其他優(yōu)良特
<br>性高效表達的重要發(fā)酵技術，除傳統(tǒng)的正交試驗優(yōu)化方法外，均勻實驗設計優(yōu)化方法、響應面
<br>法優(yōu)化設計和人工神經網絡優(yōu)化方法都得到了廣泛的應用，并取得了顯著的效果。
<br>縱觀上述，正由于工業(yè)微生物育種技術的不斷創(chuàng)新，促進了對生物發(fā)酵產業(yè)總體技術水平
<br>的提高，不僅使傳統(tǒng)生物發(fā)酵產業(yè)在工藝改進、工藝創(chuàng)新和提高產品質量等方面起到了重要的
<br>推動作用，而且也使現代生物發(fā)酵產業(yè)建立了從被動篩選到主動合成的技術平臺，促進了我國
<br>生物發(fā)酵產業(yè)的發(fā)展。
<br>思　考　題
<br>1.簡述工業(yè)生產的微生物菌種特點。
<br>2.簡述工業(yè)微生物育種技術的方法及其特點。
<br>第二章　遺傳物質的基礎
<br>生物的性狀由遺傳物質決定。隨著遺傳學的發(fā)展，遺傳物質的本質不斷被揭示。孟德
<br>爾（ G.J.Mendel）1856～1864 年在從事豌豆雜交試驗過程中，首先發(fā)現分離和獨立分配遺傳
<br>規(guī)律，認為生物性狀是受細胞里的顆粒性遺傳因子控制，但是，這種遺傳因子只是一種邏輯
<br>推理產物，沒有任何物質內容。約翰生（ W.L.Johannsen）1909 年用“基因” （gene）一詞代替
<br>孟德爾的遺傳因子概念，但也沒有給出“基因”的物質內容。貝特生（ W.Batson）和摩爾根
<br>（ T.H.Morgan） 1900～1910 年期間先后在香豌豆、果蠅的遺傳研究中發(fā)現性狀連鎖
<br>（linkage）現象。尤其是摩爾根在大量果蠅遺傳研究基礎上提出了連鎖遺傳規(guī)律，同時，結合
<br>染色體動態(tài)研究結果提出“基因位于染色體上，基因是染色體的一段片段” 。限于當時的科
<br>學水平，摩爾根還不能對基因賦予實體的內容，但他預見了基因將是一個化學實體。阿委
<br>瑞（ O.T.Avery）證明DNA 是遺傳物質。沃森（J.D.Watson）和克里克（F.H.C.Crick）于20 世
<br>紀50 年代前后提出DNA 雙螺旋結構模型，明確了DNA 是遺傳信息的載體，是遺傳物質，
<br>基因是DNA 分子上的一個片段。除了DNA 外，有些動物、植物病毒和噬菌體是以RNA 作
<br>為遺傳物質的。
<br>遺傳物質主要分布在真核生物的細胞核、原核生物的原核中。細胞質中的某些細胞器，如
<br>葉綠體、線粒體、質體等也含有遺傳物質。
<br>隨著物理、化學、分子生物學等先進技術和設備的應用，對遺傳物質基本單位―― 基因的
<br>本質、組織結構等的認識越來越深入，也賦予基因新的內容，形成基因組學這門學科。
<br>第一節(jié)　染　色　體
<br>所有細胞型生物都具有攜帶基因的結構，這種結構稱為染色體（chromosome） 。然而，染
<br>色體在原核生物與真核生物之間存在差別：原核生物的染色體由環(huán)狀雙鏈和極少的蛋白質構
<br>成，細胞中僅有單個染色體，每個染色體有單一的DNA 復制起始位點，染色體包含在核質體
<br>中。真核生物有若干條線性染色體，DNA 與大量的蛋白質緊密結合，每一真核生物具有多個
<br>DNA 復制起始位點，染色體包含在細胞核中。
<br>一、染色體形態(tài)
<br>根據著絲粒的位置可以把染色體分為四種典型的形態(tài)，它們分別是：① 中著絲粒染色體：
<br>其著絲粒位于染色體中部附近，染色體具有幾乎等長的兩臂；② 近中著絲粒染色體：其著絲粒
<br>位置偏離染色體中位，染色體具有長、短兩臂；③ 端著絲粒染色體：其著絲粒位于染色體的端
<br>部，染色體只有一個臂；④ 近端著絲粒染色體：其著絲粒幾乎位于染色體的端部，染色體有一個
<br>長臂，有一個極短的短臂（圖2.1） 。
<br>所有真核生物的染色體具有著絲粒和端粒這兩個重要區(qū)域。此外，某些染色體還具有核
<br>仁形成區(qū)。著絲粒在細胞分裂過程中，作為紡錘
<br>絲的附著點，缺乏著絲粒，細胞將無法進行正常的
<br>分裂。
<br>端粒不僅是染色體末端的一個區(qū)域，它還具
<br>有特殊的結構。在端粒區(qū)域，含有DNA 重復序列
<br>（repeat sequence） ，如人類的該序列為T TAGGG 。
<br>在生殖細胞中，每個端粒含有大量的重復序列，但
<br>是隨著體細胞衰老，端粒中的重復序列數量逐漸
<br>減少。維持端粒長度的恒定要靠端粒酶。研究發(fā)
<br>現，在體細胞中缺少端粒酶，但在腫瘤細胞中重新
<br>出現了端粒酶。
<br>核仁形成區(qū)通常存在于次縊痕區(qū)。該區(qū)含有
<br>重復的rRNA 基因，在細胞分裂間期，核仁形成區(qū)
<br>解凝聚，其周圍形成核仁。
<br>二、原核生物及病毒染色體結構
<br>以大腸桿菌為例來闡明原核生物染色體的結構特點。
<br>大腸桿菌染色體以單個雙鏈環(huán)狀DNA 分子構成，大約有4.6 × 106 bp 。這種染色體組成
<br>了大腸桿菌的擬核（核質體） 。在擬核中DNA 占80 % ，其余為RNA 和蛋白質。DNA 與蛋白
<br>質相互作用形成“腳手架”形結構（圖2.2） 。在這種結構中，DNA 鏈形成了50～100 個功能域
<br>或環(huán)。每個環(huán)都是超螺旋結構，每個環(huán)的DNA 有兩個端點被蛋白質固定。每個環(huán)大約有
<br>50～100kb 。當用微量的DNA 酶Ⅰ 處理，會使少量DNA 環(huán)成為松弛狀態(tài)，而其他環(huán)保持超螺
<br>旋狀態(tài)不變。
<br>染色體環(huán)狀DNA 功能域將進一步與DNA 結合蛋白結合。在DNA 結合蛋白質中，含量
<br>最豐富的為HU 蛋白，另外還有H唱NS 蛋白。這些蛋白質有時也稱為類組蛋白。
<br>病毒沒有典型的染色體結構。習慣上把病毒含有的RNA 或DNA 也稱為染色體。對DNA
<br>病毒來說，不同的病毒其DNA 形態(tài)結構多種多樣，如DNA 可以是單鏈，也可以是雙鏈；可以是
<br>環(huán)狀，也可以是線狀。對RNA 病毒來說，RNA 為線狀，RNA 可以為單鏈，也可以為雙鏈，甚至含
<br>